Fluoreszens-Fotografie

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Katja_ehw

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Hallo Zusammen,

ich benutze im Zuge meiner Diplomarbeit eine Nikon D300 und verzweifel langsam daran, weil ich keine verwertbaren Bilder bekomme.

Folgendes möchte ich gerne Fotografieren:
Ich habe im Labor Zellen auf einem Objekträger angezüchtet und mit Fluoreszenz-Farbe gefärbt. Unter dem Mikroskop fluoresziert mein Präparat mit entsprechendem Filter grün oder rot. Ich habe nun einen Kameraadapter für das Mikrokop und möchte ebenjene Bilder fotografieren, um sie für meine Diplomarbeit zu verwenden. Ich stelle dabei die Belichtung auf die längste Belichtungszeit ein und die ISO-Empfindlichkeit hoch (3200 oder so). Damit kommen bei starker Fluoreszenz passable, wenn auch nicht originalgetreue, Bilder heraus. Bei schwacher Fluoreszens bekomme ich aber nur schwarze Bilder.

Ich wäre wirklich dankbar, wenn jemand von euch einen Tipp hat, wie ich anständige Bilder bekomme.
Bin absoluter Fotografie-Laie, daher wenns geht, nicht in Fachchinesisch :)
Danke!!!
Katja
 
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jazzmasterphoto

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... Ich stelle dabei die Belichtung auf die längste Belichtungszeit ein und die ISO-Empfindlichkeit hoch (3200 oder so). ...


Hallo Katja,

erst einmal "Willkommen im NF-F!".

Was meinst Du bittschön mit "längste Belichtungszeit "?
Die längstmögliche Standardeinstellung bei der D300 sind 30 Sekunden,
was in Kombination mit 3200 ISO einen schwarzen Kohlenkeller in ein
weißes Brautgemach verwandelt, um es einmal so sagen.

Versuch es doch mal ganz simpel mit "A" (wie Automatik) und 400 ISO
mit Matrixmessung und Auto-WB.

Wie Du das einstellst, verrät Dir das Handbuch der D300, welches Du
hoffentlich (gelesen) hast.
Falls nicht, kannst Du es bei Nikon (so Du dort angemeldet bist) laden.

Wenn "A" keine brauchbaren Ergebnisse bringt, sehen wir weiter.


Beste Grüße,

Sven


.
 
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Rolo1234

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Hallo Katja,
stell die Kamera mal am linken oberen Einstellrad auf "MUP" (Langzeitbelichtung).Iso 200. Dann drückst Du auf den Auslöser (Verschluss öffnet). Nach 3-4 Stunden drückst Du wieder auf den Auslöser (Verschluss schließt). Willst Du das Bild dann doppelt so Hell erhöhe die Belichtung auf 6-8 Std. Ist Dir das Bild zu hell - du hast es erfasst - Belichtungszeit entsprechend verringern.
Stell die bildqualität auf RAW + JPG. Wenn das JPG von den Farben her in Ordnung ist - gut. Wen nicht, dann kannst Du in den RAW-Daten den Weißabgleich nach Deinen Wünschen ändern und das Bild dann mit den korrekten Farben als JPG abspeichern.

Gutes Gelingen :)


Nachtrag: Bitte Beitrag #5 beachten. Hab mich hier vertan
 
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mbreu

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stell die Kamera mal am linken oberen Einstellrad auf "MUP" (Langzeitbelichtung).Iso 200. Dann drückst Du auf den Auslöser (Verschluss öffnet).
MUP ist lediglich die Spiegelvorauslösung und hat mit Langzeitbelcihtung nicht viel zu tun. Die gewünschte Betriebsart heißt dann "B" (Bulb).


Nach 3-4 Stunden drückst Du wieder auf den Auslöser (Verschluss schließt). Willst Du das Bild dann doppelt so Hell erhöhe die Belichtung auf 6-8 Std.
Das Sensorglühen bei diesen Belichtungszeiten möchte ich gerne sehen.
 
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Rolo1234

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MUP ist lediglich die Spiegelvorauslösung und hat mit Langzeitbelcihtung nicht viel zu tun. Die gewünschte Betriebsart heißt dann "B" (Bulb).
Oh Mist, Du hast natürlich recht. War ein langer Arbeitstag. :fahne:
Natürlich muss das Einstellrad oben rechts vorne im Modus "M" so lange in Richtung längere Belichtungszeit gedreht werden bis "bulb" erscheint. Dann muss man so lange den Auslöser drücken, bis man die Belichtung beenden will.
Das Sensorglühen bei diesen Belichtungszeiten möchte ich gerne sehen.

Na ja, Fluoreszenz ist jetzt nicht wirklich sehr hell unter einem Mikroskop. Vor allem, wenn noch Filter dazwischen sind. Ich hab jetzt mal grob geschätzt. Alternativ kann man ja auch mit 15 Minuten anfangen und je nach Ergebnis die Zeit verändern. Aber bei 3200 ISO mit 30 Sekunden belichtet und absolut dunklen Bildern glaube ich eher an längere Belichtungszeiten.
 
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Alaun

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ne blöde Frage: Kommt denn an der Kamera genau so viel Licht an wie am Okkular? Richtig umgeschaltet, keine Zusatzfilter etc., die beim Okkular nicht eingeschaltet sind? Mikroskope sind manchaml kompliziert.


Liebe Grüße
Alaun
 
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mbreu

Sehr aktives Mitglied
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ne blöde Frage: Kommt denn an der Kamera genau so viel Licht an wie am Okkular? Richtig umgeschaltet, keine Zusatzfilter etc., die beim Okkular nicht eingeschaltet sind? Mikroskope sind manchaml kompliziert.


Liebe Grüße
Alaun
Die Menge des Lichts das am Sensor ankommt hängt von der gewählten Blende und der Belichtungszeit ab. Ganz so einfach ist das nicht und eine Ferndignose, zumal in einem so speziellen Fall, recht schwer.
Wie wäre es wenn Du Deine ersten Ergebnisse hier zeigst, damit wäre es leichter Dir ein paar Tips zu geben.
 
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Quenhorn

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Hallo Katja

Hat das Mikroskop eine Durchleuchteinheit ?
Dann würde es helfen das Leuchtmittel entsprechend des eingesetzten Fluoreszensmittels ( siehe Datenblatt des Herstellers ) zu tauschen.

Wir nutzen für Dichtprüfungen an Schweißverbindungen z.B. Penetrieroel das unter Schwarzlich sehr gut sichtbar wird.

Könnte Montag mal einen fotografischen Versuch starten.

Du wirst sicherlich viel Licht u. evtl. Filter einsetzen müssen......

mfG Paul

PS: Frage doch mal den Laborleiter oder deinen Ansprechpartner in der Firma , die kennen sich i.d.R. auch Aufgabenübergreifend gut aus. Du bist ja wahrscheinlich nicht die erste Diplomantin in dem Werk / Labor.... Eine Anfrage im QM schadet auch nie !

Der Lieferant / Hersteller / Importeur der Fluoreszenz-Farbe wird doch im Web nicht nur Produktfotos sondern auch Anwendungsbeispiele eingestellt haben....
Da du den Hersteller eh wirst nennen müssen , dein Aufbau sollte ja nachprüfbar sein , kann er dir doch Tips zum Fotografieren liefern .
 
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Alaun

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Die Menge des Lichts das am Sensor ankommt hängt von der gewählten Blende und der Belichtungszeit ab. ...

Bei Vergrößerungen über 8x bis 10x sollte man die Blende -soweit denn eine vorhanden ist am Mikroskop- auflassen, ansonsten leidet die Bildqualität (Stichwort: Diffraction).

Wichtig ist zunächst mal, was unten für ein Objektiv drauf ist. Auf dem Objektiv stehen so in paar Bezeichnungen drauf, die solltest Du Dir mal anschauen.

Wenn Deine Uni eine gute Bibliothek hat:
"Digital Photography For Science", by Enrico Savazzi, 2011, pp.368
Was dort zum Einsatz von Mikoroskoplinsen (Objektiv) steht, gilt auch für das Photographieren zusammen mit dem Mikroskop (man kann die Linsen auch ohne Mikroskop an eine Kamera schrauben ;-)).

Liebe Grüße

PS: Wenn Du auf dem Präparat auch noch ein Glasplättchen liegen hast, sollte die Dicke des Plätchens zur Objektiv passen.
Alaun
 
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dmachaon

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Ich stelle dabei die Belichtung auf die längste Belichtungszeit ein und die ISO-Empfindlichkeit hoch (3200 oder so). Damit kommen bei starker Fluoreszenz passable, wenn auch nicht originalgetreue, Bilder heraus. Bei schwacher Fluoreszens bekomme ich aber nur schwarze Bilder.

hallo katja,
ich habe in meiner diss ähnliches gemacht: fluoreszenzaufnahmen von zellen.
ich empfehle dir
- lad mal ein bild mit exifs hoch, sonst bleibt das stochern im nebel
- leuchtet dein präparat überhaupt hell genug, siehst du etwas im okular?

Na ja, Fluoreszenz ist jetzt nicht wirklich sehr hell unter einem Mikroskop.

also mein verwendetes mikroskop hat die nacht zum tage gemacht, das war richtig hell!

Dann würde es helfen das Leuchtmittel entsprechend des eingesetzten Fluoreszensmittels ( siehe Datenblatt des Herstellers ) zu tauschen.

ich denke, es ist vielleicht einfacher, das problem der aufnahme erstmal zu sehen, bis man mal das fluoreszenzmittel (dummerweise vielleicht noch gelabelte sekundärantikörper) zu tauschen? das kann wochen dauern.
auch das rumschrauben an einem fluoreszenzmikroskop oder objektive tauschen... wisst ihr, wie teuer so ein ding ist?
 
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Katja_ehw

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Wow, mit soviel Rückmeldungen hab ich gar nicht gerechnet, danke!
Werde morgen eure Tipps in die Tat umsetzen und hoffen, dass ich bessere Bilder bekomme.

Bin mir nicht ganz sicher wie das mit dem Bilder Anhängen hier funktioniert. Falls es geklappt hat, sieht man auf dem einen Bild, dass bei starker Fluoreszenz ganz ordentliche Bilder rauskommen. Beim zweiten Bild... naja, wie man sieht, sieht man nichts... Und unterm Mikroskop bekomm ich eigentlich gute, scharfe Bilder, ich kriege sie nur nicht fotografiert.

Irgendetwas am Mikroskop austauschen kommt nicht wirklich in Frage, wie schon erwähnt wurde, die Dinger sind tierisch teuer und ich hab damit wahrscheinlich schon sämtliche Budgets gesprengt...

Achja, ich mikroskopiere mit Auflicht. Lichtquelle ist LED, durch entsprechende Filter geleitet.
 

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Quenhorn

Sehr aktives Mitglied
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Irgendetwas am Mikroskop austauschen kommt nicht wirklich in Frage, wie schon erwähnt wurde, die Dinger sind tierisch teuer und ich hab damit wahrscheinlich schon sämtliche Budgets gesprengt...

Achja, ich mikroskopiere mit Auflicht. Lichtquelle ist LED, durch entsprechende Filter geleitet.

Hallo Katja

Niemand hat die Absicht ein Budget zu sprengen ... :rolleyes:

Eine 08/15 herangehensweise an eine Diplomarbeit kann weder in deinem noch in dem des Finanz - Recourcengebers sein ......

Eine Diplomarbeit mit beiderseitigem Nutzen sollte nicht nur in € bewertet werden.
Du investierst Zeit, Hirnschmalz u. einen neuen Blick bezüglich herangehensweise u. dokumentation etc .

Wenn ich mal so überlege was unsere Diplomanten für Freiheiten haben ......
Von dieser erlaubten Kreativität träumen manche Festangestellten .....

Meine Anmerkungen unter PS hast du gelesen ?

mfG Paul
 
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dmachaon

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ich kenne ein paar überzieher, aber auch deren studiengang wurde irgendwann zwangsumgestellt. logo, welche uni hält sich die ganze stange an kursen und stellen für ein paar nachzügler warm?
 
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marshaj

Nikon-Clubmitglied
NF Club
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Ich habe mich viele Jahre im Viruslabor mit Zell-Fluoreszenz über Antikörpermarkierungen beschäftigt und bin über die Angabe einer "stundenlangen" Belichtung erstaunt. Mit einem 400 ASA Farbdiafilm hatte ich meistens Belichtungszeiten von 10 - 30 sec. Das hängt natürlich auch von der Lichtquelle ab. Wenn es sich um etwas ähnliches wie eine 200 W Halogenlampe handelt, dann sollten auch solche Belichtungszeiten drin sein.

Wenn die Lampe deutlich schwächer ist, dann müßte man zwar länger belichten, da die Fluoreszenz aber bei den meisten Farbstoffen relativ schnell ausbleicht, erreicht man auch mit einer Stunden-Belichtung nicht viel mehr.

Mein Versuchsansatz wäre wie folgt:
Kontrollieren, ob die Lampe richtig zentriert ist,
ob eine Blende im Strahlengang von der Lampe zum Mikroskopstativ sitzt und diese ggf. öffnen;
vor der Aufnahme das evtl. vorhandene Strahlenteiler-Prisma herausziehen,
ein Ölimmersionsobjektiv nehmen;
Spotmessung auf die Zelle (!),
A-Einstellung,
erste Versuche mit ISO-Automatik, dann Reduzierung der ISO auf min. 800 (weiter 'runter ist für die Druckqualität einer Diplomarbeit sowieso nicht von Interesse).
Spiegelvorauslösung ist bei diesen Belichtungszeiten nicht notwendig.

Aus Rohdatenformat-Aufnahmen (RAW, bei Nikon *.nef) lassen sich auch bei stärkerer Unterbelichtung noch brauchbare Bilder generieren, allerdings nur, wenn man dafür geeignete Software verwendet (z.B. Nikon ViewNX2, kostenlos).


.
 
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Iguana

Aktives NF Mitglied
Registriert
Hallo Katja,

fotografierst du durch das Okular des Mikroskops (mit welchem Objektiv auf der Kamera), oder ist die Kamera über einen Adapter an einen c-mount des Mikroskops geschraubt?
Sind die Zellen GFP-getagged? Wenn du durch das Okular mit deinen Augen ein vernünftiges Bild siehst, dann solltest du es eigentlich auch im Live-View Modus der Kamera sehen. Du wirst wahrscheinlich manuell fokusieren müssen, damit das Bild scharf wird.
Wenn du nicht durch Okular fotografierst muss du aufpassen dass der Strahlenteiler dann entsprechen richtung c-mount gestellt ist. Meist gibt es da Einsellungen 100% Okular, je 50% Okular/c-mount und 100% c-mount. Die letzte wäre dann die richtige um das ganze Licht Richtung Kamera zu schicken. Vllt. kannst du auch mal den Typ deines Mikroskops posten.

Ansonsten gibt es bei euch (Uni?) vielleicht ja auch ein dediziertes Fluoreszenmikroskop mit angeschlossener Kamera, welche mittels entprechender Software bedient wird.

Grüße, Martin
 
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